GDS-80基因枪投递大鼠DNA质粒载体验证DDR2的表达
摘要:在《Biochemical and Biophysical Research Communications》的一篇报道中,实验人员通过GDS-80基因枪低压加速将质粒转染到血管平滑肌细胞。将两微克质粒DNA悬浮于5微升PBS中并递送至VSMC。该方法的转染效率为25%。研究结果提示缺氧在转录水平上诱导血管平滑肌细胞中DDR2的表达,这是由p38mapk通路介导的,并且有助于血管平滑肌细胞的迁移。报告中提供的数据阐明了缺氧在 DDR2 表达和 VSMC 中的作用以及 DDR2 对 VSMC 迁移响应缺氧条件的贡献。
细胞与环境之间的通讯是由特定的细胞表面受体介导的,这些受体将外部信号传递到细胞内部。
一类重要的信号受体是受体酪氨酸激酶(RTKs),它在许多基本的细胞过程中起着至关重要的作用。这个家族的两个成员,盘状结构域受体1和2(DDR1和2)是不寻常的RTK,因为它们的配体是细胞外基质(ECM),而不是生长因子样肽。DDRs与多种胶原蛋白结合,刺激基质金属蛋白酶(MMP)的产生,后者能消化ECM蛋白,促进细胞迁移。DDR2存在于血管和间充质细胞中,并对I型胶原和Ill型胶原纤维作出反应。研究表明,DDR2在被I型胶原激活后与Src相互作用。因此,DDR2需要Src活性来显示最大水平的酪氨酸磷酸化。
盘状结构域受体-2(DDR2)是一种与细胞外基质结合的受体酪氨酸激酶。在《Biochemical and Biophysical Research Communications》的一篇报道中,实验人员研究了缺氧在血管平滑肌细胞(VSMC)DDR2表达中的作用及其机制。
缺氧(2.5%O2)诱导血管平滑肌细胞DDR2表达;用p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)或p38特异性小干扰RNA(siRNA)的特异性抑制剂(SB203580)治疗可消除缺氧诱导的DDR2表达。
凝胶转移实验表明缺氧增加了DDR2启动子区Myc-Max-DNA结合活性;SB203580和p38特异性siRNA抑制p38-MAPK活化,阻断缺氧诱导的DDR2启动子活性。缺氧还可诱导血管平滑肌细胞的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)活性,增加其迁移。这些VSMC对缺氧的反应被DDR2和p38特异性siRNA抑制。
研究人员通过A-490至+66bp大鼠DDR2启动子构建体。简言之,用5'-gacagaaggactgcatttaag-3'和5'-gattcaactgtccggccgctt-3'反义引物扩增大鼠基因组DNA。扩增产物用M1ul和Bg1ll限制性内切酶消化,连接到pGL3碱性荧光素酶质粒载体(Promega,Madison,WI)中,用相同的酶消化。DDR2启动子包含Myc最大保守位点(ACGTG),位于-258至-254 bp。为了构建DDR2突变体,使用突变试剂盒对Myc Max结合位点进行突变。用GDS-80基因枪低压加速将质粒转染到血管平滑肌细胞。将两微克质粒DNA悬浮于5微升PBS中并递送至VSMC。该方法的转染效率为25%。用双荧光素酶报告分析系统制备细胞提取物,并用光度计测量。
研究结果提示缺氧在转录水平上诱导血管平滑肌细胞中DDR2的表达,这是由p38mapk通路介导的,并且有助于血管平滑肌细胞的迁移。报告中提供的数据阐明了缺氧在 DDR2 表达和 VSMC 中的作用以及 DDR2 对 VSMC 迁移响应缺氧条件的贡献。
[1] Hypoxia induces discoidin domain receptor-2 expression via the p38 pathway in vascular smooth muscle cells to increase their migration[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 374(4):662-667.
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