GDS-80低压基因枪转染大鼠心肌细胞验证肌肉生长抑制素表达
摘要:在《Journal of Endocrinology》杂志刊发的一篇报告中,研究人员使用GDS-80低压基因枪将质粒转染入心肌细胞,遵循制造商的方案。将2微克质粒DNA悬浮于5微升PBS中,并在15 psi的氦气压力下输送至培养的心肌细胞。该方法的转染效率为25%。经6小时AngII刺激后,用双荧光素酶报告系统制备细胞提取物,并用光度计测定双荧光素酶活性。结果表明,AngII可增强培养的大鼠心肌细胞中肌肉抑制素的表达。AngII诱导的肌肉生长抑制素通过p38-MAP激酶和MEF-2途径介导。
血管紧张素Ⅱ(AngII)在心肌重塑中起重要作用,促进心肌细胞肥大。肌生长抑制素是肌肉生长的负调节因子,在肥厚和梗死的心脏中增加。由于肌生长抑制素在限制骨骼肌生长中起作用,肥厚心脏中肌生长抑制素的上调可能代表心肌细胞中肌生长抑制素抑制心肌细胞过度生长的负反馈机制。
在《Journal of Endocrinology》杂志刊发的一篇报告中,实验人员发现机械拉伸是通过 p38 MAP 激酶和 MEF-2 途径诱导肌生长抑制素表达。AngII对心肌细胞myostatin表达的直接影响尚未被研究。AngII诱导培养乳鼠心肌细胞myostatin蛋白表达呈剂量依赖性。AngII以时间依赖的方式显著增加myostatin蛋白和mRNA的表达。在AngII刺激前30分钟加入氯沙坦、SB203580或p38 siRNA可显著阻断AngII对肌生长抑制素蛋白的增加。AngII显著增加p38的磷酸化,而SB205380和氯沙坦则减弱AngII诱导的p38的磷酸化。AngII增加,而myostatin Mut质粒、SB203580、氯沙坦和心肌细胞增强因子2(MEF-2)抗体可抑制myostatin启动子活性。myostatin和AngII共刺激显著抑制AngII诱导的蛋白质合成。
研究人员构建了一个-1977至+32bp的小鼠肌生长抑制素启动子。肌生长抑制素蛋白启动子包含MEF-2保守位点(ctaataa),位于-637到-646bp之间。对于突变体,使用突变试剂盒对MEF-2结合位点进行突变。DNA测序证实了位点特异性突变。使用GDS-80低压基因枪将质粒转染入心肌细胞,遵循制造商的方案。将2微克质粒DNA悬浮于5微升PBS中,并在15 psi的氦气压力下输送至培养的心肌细胞。该方法的转染效率为25%。经6小时AngII刺激后,用双荧光素酶报告系统制备细胞提取物,并用光度计测定双荧光素酶活性。
在这项研究中,研究人员证明了 AngII 上调了心肌细胞中肌生长抑制素的表达,并且 p38 MAP 激酶和 MEF-2 转录因子参与了肌生长抑制素诱导的信号通路。心肌细胞通过肥大生长对增加的机械负荷和激素刺激作出反应,但机械应力或激素因素也是触发心肌细胞退化和死亡的初始步骤的重要刺激,这在适应不良的心肌重塑和心力衰竭中起关键作用。
在没有 AngII 刺激的情况下,外源性添加肌肉生长抑制素对心脏肥大没有影响。这些结果表明 AngII 对肥大和肌生长抑制素表达的作用是违反直觉的。尽管 p38 MAP 激酶是几乎所有真核细胞类型中生长和应激刺激的重要传感器,但 p38 MAP 激酶信号在心脏肥大中的作用仍存在争议。
SB203580是p38 MAP激酶的强效特异性抑制剂,完全抑制AngII诱导的肌生长抑制素表达,而PI-3激酶抑制剂不具有抑制作用,JNK和p42/p44 MAP激酶抑制剂具有部分抑制作用。这些数据暗示 p38 MAP 激酶途径,而不是 JNK、p42/p44 MAP 和 PI-3 激酶途径是介导 MEF-2 转录活性增加的重要信号通路。
总结起来,AngII可增强培养的大鼠心肌细胞中myostatin的表达。AngII诱导的肌肉生长抑制素通过p38-MAP激酶和MEF-2途径介导。
[1] Angiotensin II activates myostatin expression in cultured rat neonatal cardiomyocytes via p38 MAP kinase and myocyte enhance factor 2 pathway[J]. Journal of Endocrinology, 2008, 197(1):85-93.
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